準(zhǔn)確PCR結(jié)果，少不了電動移液器

    摘要    

定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）分析具有高靈敏度，這是其成功并廣泛應(yīng)用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)室的最重要原因之一。然而，包括移液技術(shù)在內(nèi)的許多因素都會對qPCR分析的結(jié)果產(chǎn)生影響。PCR Master Mix 通常在qPCR準(zhǔn)備期間使用，但可能很難對其進(jìn)行準(zhǔn)確移液。在本研究中，我們測試了在qPCR中使用電動移液器移取Master Mix。研究證明，使用電動移液器搭配低吸附濾芯吸頭或標(biāo)準(zhǔn)濾芯吸頭對Master Mix移液，可獲得良好的精準(zhǔn)性，并能確保移液速度及結(jié)果的重現(xiàn)性。從而得出結(jié)論，在進(jìn)行基于PCR的分析時，使用電動移液器移取Master Mix確保得到可重復(fù)且可靠的結(jié)果。

    引言    

基于PCR的應(yīng)用已成為生物制藥工藝、臨床診斷和學(xué)術(shù)研究的關(guān)鍵手段。然而，在執(zhí)行定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）時，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可變性可能是個問題，移液誤差是需要重點(diǎn)關(guān)注的變化來源之一。在qPCR準(zhǔn)備階段，對Master Mix試劑進(jìn)行移液具有挑戰(zhàn)性。Master Mix通常由聚合酶、dNTP、MgCl2以及可能含吐溫和甘油成分的緩沖液組成。

本應(yīng)用說明的目的是測試在PCR分析應(yīng)用中使用電動移液器移取Master Mix的可靠性。在定量PCR準(zhǔn)備階段，使用電動移液器搭配低吸附濾芯吸頭來移取Master Mix，實(shí)驗(yàn)結(jié)果（定量循環(huán)，Cq）由準(zhǔn)確度和精準(zhǔn)度（重現(xiàn)性）來進(jìn)行評價。

    方法    

移液器和移液器吸頭選擇

使用Picus®電動移液器、Safetyspace低吸附濾芯吸頭和濾芯吸頭。Picus®使用多次分液模式。移取Master Mix時，將電動移液器速度參數(shù)設(shè)置為1。

   qPCR準(zhǔn)備   

qPCR準(zhǔn)備階段使用Picus®電動移液器、Safetyspace濾芯吸頭及低吸附濾芯吸頭。Lo-Bind EP管用于DNA樣品制備及Master Mix的制備。制備用于所有測試的PCR Master Mix儲備液使用了MaximaSYBR Green qPCR Master Mix（不含ROX）、大腸桿菌uidA基因引物以及無核酸酶水。

用移液器將八個 15μL 的Master Mix重復(fù)樣品移取至PCR板孔中，用于各種測試條件。無模板對照（NTC）樣品不含大腸桿菌基因組DNA，并加入 5μL 無核酸酶水。用類似方法移取 5μL 含有1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³ 以及1×10² 個拷貝丨反應(yīng)大腸桿菌gDNA的系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。

在每個測試孔中有 5μL 含有1×10³ 個拷貝丨反應(yīng)的大腸桿菌gDNA。使用Picus® 電動移液器的多次分液功能及低吸附濾芯吸頭以相同的方式將所有DNA樣本添加到PCR管中。使用LightCycler®480 qPCR儀進(jìn)行qPCR。循環(huán)參數(shù)如下：在 95°C下預(yù)培養(yǎng) 10 分鐘，隨后在 95°C 10 秒、55°C 10 秒、75°C 15 秒，75°C延伸 10 秒，40 次循環(huán)。

對標(biāo)準(zhǔn)品、對照品和樣品中的SYBR綠色熒光激發(fā)進(jìn)行定量。使用LightCycler® 480軟件確定定量循環(huán)（Cq）值和實(shí)際拷貝數(shù)，并使用MS Excel分析結(jié)果。

    數(shù)據(jù)分析   

Cq值的百分比系統(tǒng)誤差（%S）反映了處理Master Mix的儀器系統(tǒng)（移液器和吸頭系統(tǒng)）Cq值的誤差。移液過程中的隨機(jī)誤差是結(jié)果精準(zhǔn)度的測量，反映了實(shí)驗(yàn)中重復(fù)樣品之間的差異。Cq值的百分比隨機(jī)誤差（%R）反映了結(jié)果的重現(xiàn)性，并且可能受到實(shí)驗(yàn)人員移液操作的影響。

    結(jié)果    

如圖1所示，當(dāng)使用低吸附濾芯吸頭移取Master Mix 時，電動移液器的多次分液模式所得結(jié)果為：Cq=24.54±0.09、Cq的百分比系統(tǒng)誤差=0.12、Cq的百分比隨機(jī)誤差=0.37；相比之下，采用標(biāo)準(zhǔn)濾芯吸頭所得結(jié)果為：Cq=24.52±0.16，Cq的百分比系統(tǒng)誤差=0.04，Cq的百分比隨機(jī)誤差=0.67。

在這兩種情況下，使用電動移液器所得的結(jié)果都具有良好的重現(xiàn)性（百分比隨機(jī)誤差），且Cq值的百分比系統(tǒng)誤差均保持在低水平。電動移液器的多次分液模式可確保通過一次吸液后，將Master Mix按順序分配到所有八個重復(fù)孔中，顯著提高了移液速度也減少了移液器吸頭的使用數(shù)量，更環(huán)保的同時也減少了更換吸頭造成的差異。

    討論    

研究證明，在PCR準(zhǔn)備階段使用電動移液器可以得到出色的結(jié)果，結(jié)果的百分比誤差很低。與標(biāo)準(zhǔn)濾芯吸頭相比，使用電動移液器的多次分液模式搭配低吸附濾芯吸頭可提供更好的結(jié)果。對于仍使用標(biāo)準(zhǔn)移液器吸頭移取Master Mix的實(shí)驗(yàn)室來說，多次分液搭配標(biāo)準(zhǔn)濾芯吸頭可提供次佳的結(jié)果重現(xiàn)性（精準(zhǔn)度）。

 Conclusion

基于PCR原理的實(shí)驗(yàn)中使用電動移液器移取Master Mix可確保高準(zhǔn)確度和精準(zhǔn)度。此外，電動移液器可加快完成實(shí)驗(yàn)的速度，減少移液所需的時間，使操作更符合人體工程學(xué)。因此，使用電動移液器可以降低實(shí)驗(yàn)室工作人員患上重復(fù)性勞損（RSI）的可能性，并使實(shí)驗(yàn)更不容易出錯，它還能在相同的實(shí)驗(yàn)中使用更少的移液器吸頭，因此也是更環(huán)保的選擇。